俄罗斯专享会294的冻存原理主要基于温度对细胞生命活动的影响。当细胞温度降至0°C以下时，细胞会经历脱水，其内部溶解物质浓度升高，并可能形成冰晶。冰晶的大小对细胞产生不同程度的影响，大型冰晶容易导致细胞膜及细胞器损伤和破裂，从而显著降低复苏后细胞的存活率及功能。因此，在冻存细胞时，我们通常采取两项措施：一是加入低温保护剂，二是实施慢冻操作。

俄罗斯专享会294建议冻存时机应选择在细胞生长良好、密度达到80-90%、数量一般在106-107/ml的状态下进行。活力低下的细胞，经过冻存后的存活率往往较低。

低温保护剂中，二甲基亚砜（DMSO）广泛应用。它不仅能迅速渗透细胞，还提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，并延缓冻结过程。这使得细胞内的水分能够在冻结前有效地排出细胞外，形成胞外冰晶，从而减少胞内冰晶的产生，降低对细胞的损伤。

实施慢冻细胞的方法可以通过程序降温盒来进行，这样能有效防止大冰晶的产生。如果没有程序降温设备，亦可依次将细胞放置在4°C（1小时）、-20°C（2小时）与-80°C（过夜）中，这样大多数细胞也能适应。

冻存液的配制应提前进行，在室温下备用，以防临时配制时产生的热量损伤细胞（因DMSO加入培养基时会释放热量）。常规冻存液的比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1；若细胞较为珍贵，可调整为血清：DMSO=9:1。

俄罗斯专享会294的操作步骤如下：

1. 用移液器吸去原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍。
2. 消化细胞：加入适量胰酶，并放入37°C培养箱进行消化（在10厘米大皿中加入1ml 0.25% 胰酶，消化约4-5分钟，视细胞类型而定，终止消化的标志为80%-90%的细胞变圆）。
3. 消化完成后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，800-1000rpm离心3-5分钟。
4. 准备冻存管，标记日期、细胞类别、操作人及代数，细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移到冻存管中。
5. 将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜，随后转移至液氮中保存。

注意事项包括：

• 细胞添加冻存液后，需立即放入-80°C保存，避免常温下放置过久。
• 冻存细胞在-80°C储存一般不建议超过半年，而在液氮中通常不建议超过2年。