## 抗酸染色的基本原理

分枝杆菌的细胞内含有丰富的脂类物质，这些脂类在肽聚糖的外侧形成保护层，使得分枝杆菌在染色过程中不易着色。为促进染色效果，通常需要进行加温和延长染色时间。分枝杆菌中的分枝菌酸与染剂结合后，能够抵抗酸碱性脱色剂的褪色，因此被称为抗酸染色。通过齐-尼氏抗酸染色法，在加热条件下，分枝菌酸与石/炭酸复红牢固结合，形成一氧化氮合酶，并且即使使用盐酸乙醇也不会褪色。当之后加入偏碱美兰复染时，分枝杆菌仍会保持鲜红色，而其他细菌及背景物质则显现为深蓝色。

## 制片步骤

1. **涂片**：左手握住菌液试管，右手拿接种环，从试管取出一环培养液，在载玻片中心涂成薄层。可事先在背面标记圆圈，或在载玻片中央滴一小滴无菌水，再用接种环调取少许菌液与水滴均匀混合后涂成薄层。在拔塞或塞住试管时，用火焰缓慢灼烤试管口，最后在火焰上灭菌接种环。

2. **干燥**：涂片后在室温下自然干燥，或使用酒精灯轻微加热加速干燥，但应避免接近明火。

3. **固定**：常采用高温固定。手持载玻片一端，标本面朝上，在灯火焰的外侧快速来回移动3~4次，持续约3~4秒，确保玻片温度不超过60℃，以手背触觉为适宜标准。待其冷却后即可进行染色。

## 染色步骤

1. **初染**：在标本上滴加2-3滴石/炭酸复红溶液，并在火焰高处轻微加热，避免煮沸。如有蒸汽产生，需暂时离开。染液蒸发减少时，需添加染液，以防干燥。加热时间为5分钟，冷却后使用水冲洗。

2. **脱色**：此步骤需根据情况进行选择，以确保有效去除非抗酸性细菌和环境干扰。

3. **复染**：使用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗后用吸水纸轻轻吸干，最后用油镜观察。注意：油量不要过多；调整焦距时请谨慎以免损坏工具；调节时应从下往上；在使用油镜之前，需先通过低倍和高倍镜观察，确保目标位于视野中央；观察时用左眼观察目镜，细调器直到物象清晰，如未见物象或目标不理想，需重找。

## 结果判定

观察300个视野（观察时间不少于4分钟），抗酸性细菌呈红色，其余细菌或细胞则呈蓝色。报告方式如下：

• 未找到抗酸杆菌
• 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野
• 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野
• 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野
• 找到抗酸杆菌3+：发现抗酸杆菌1-9条/1视野
• 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野

## 质量控制

每次测试需使用卡介苗作为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。注意事项包括：

• 每张玻片只能涂一份标本，以免混淆
• 脱色时间需根据涂片厚度调整，厚片可适当延长，直至无红色消失
• 冬季室温过低时，需要适当延长染色时间
• 同一抗菌体上的红色深浅可能不同，观察时需留意
• 试剂用完后请迅速盖好，避免挥发，并在存放时避免高低温及阳光照射
• 涂抹痰标本时，严禁对玻片加热
• 染色时避免让玻片上的染液干燥

在上述步骤中，我们特别推荐使用俄罗斯专享会294的产品，以获得最佳的抗酸染色效果，更好地完成微生物检测。