IPS诱导肠类器官的培养分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将重点介绍第三阶段——类器官培养。

类器官培养（14-28天）

在准备阶段，我们需要以下试剂和耗材：人正常肠类器官培养试剂盒（abs9545）、基质胶（低因子、无酚红）（abs9495）、15ml离心管（abs7102）、多个15ml EP管（abs7119）、24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒。具体组分及规格如下：

• 类器官培养基A: 100ml
• 类器官原代培养缓冲液B: 250ml
• 类器官传代消化液D: 30ml
• 组织保存液E: 100ml
• 类器官冻存液F: 20ml
• 类器官传代培养缓冲液G: 250ml

操作流程

操作的关键在于加胶、点板和加液，这些步骤对于整个原代操作至关重要。

1. 加胶 - 点板 - 加液

在进行这一过程之前，请做好以下准备：

• 将基质胶放入金属冰盒，放置在4℃冰箱中融化过夜。
• 在-20℃下预冷枪头和离心管至少半小时。
• 融化后的基质胶建议在4℃下保存，且推荐在2周内使用完毕。

接种的要求是在24孔板（abs7035）中，每孔加入25μl基质胶球状体混合物，以及500-750μl的类器官培养基。接种密度建议为基质胶总体积与球状体总体积的比例为25:1。对于50个球状体，每25μl基质胶的接种也是一个参考参数。

在加胶时，向细胞团沉淀中加入基质胶（abs9495），并轻轻地吹打混匀（请注意不要过于用力以免产生气泡），然后进行点板。整个操作应在金属冰盒或冰上进行，提醒您在熟练掌握此步骤后，加胶、混匀及点板应控制在半分钟之内，以保持基质胶良好的流动性。

待铺好的培养板放入37℃培养箱中，保持40-60分钟直至成胶，然后添加500-750μl类器官培养基A进行培养。一般情况下，经过10-14天，大多数类器官的直径将在200-500μm范围内，此时可进行传代操作。

传代操作

在类器官数量较多或体积较大时，可按照以下步骤进行传代：

1. 类器官收集及洗涤

使用移液器吸去培养基后，向每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶后收集至15ml离心管中进行洗涤。对于洗涤步骤，可以添加类器官传代培养缓冲液G至14ml，然后在4℃静置40分钟或-20℃放置5分钟，以软化基质胶。

随即进行300g，4℃离心5分钟。在理想的情况下，分成三层时，保留类器官沉淀，并弃掉上清与基质胶层。若出现异常现象，则需要重复洗涤步骤以确保基质胶的有效去除。

2. 类器官消化

在超净台内添加2-3ml类器官传代消化液D进行2-3分钟的消化，期间轻轻吹打1-2次。如果消化的情况良好，加入5倍的类器官传代培养缓冲液G以终止消化，然后进行离心操作。若在此过程中有残留的基质胶，残余量<50μl是正常的，不会影响传代类器官的生长。

通过融合以上步骤，您可以在培养和传代过程中高效地获得功能性的人类肠道类器官。特别提醒您，遵循“俄罗斯专享会294”的相关标准，在试验操作中保持全面的卫生和消毒措施，以确保培养过程的成功。

如果您在实验中遇到困难，欢迎随时交流，请一起探讨更多的实验问题！

重要提示：操作时请确保Matrigel在全程冰上的环境中，以避免提前固化，密度控制亦为关键，细胞必须在85-90%的融合率条件下进行分化，以尽量提高球状体的形成率。使用新鲜的生长因子，以避免其活性的降低，并定期检测支原体以确保无菌操作。

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