流式细胞术（Flow Cytometry）是一种结合了细胞生物学、免疫学和流体力学等多个学科的生物学技术，广泛应用于生物医学领域，如免疫学、血液学和肿瘤学等研究。在进行流式细胞实验时，必须严格遵循操作规程，以确保实验结果的准确性。本期我们将从样本处理、实验设计、抗体染色及仪器检测四个关键方面，探讨流式实验中的注意事项。

1. 样本处理

在流式细胞术中，需收集足够数量且具有完整活性的细胞样本。根据不同类型样本，可采用适宜的方法制备单细胞悬液。

① 单细胞悬液制备：
外周血样本：一般在采血后使用肝素进行抗凝处理，并分离红细胞。对于需要后续刺激培养的细胞，建议采用Ficoll分离法。
实体组织样本：使用机械研磨或酶解法处理以形成单细胞悬液。

② 细胞样本收集：
冻存细胞在冷冻和解冻过程中会产生应激反应，因此推荐在培养或传代后，待细胞的表型和生物功能恢复后再进行检测。在收集和清洗细胞样本时，需控制离心机离心力不超过300×g，避免使用过快的升速和降速。样本制备完成后，应在染色前统计细胞数量并调整悬液密度，确保实验组之间的一致性。

2. 实验设计

在选择实验指标时，应优先选用表达量高的指标，且考虑选择位于细胞膜外的表面蛋白作为检测目标，以简化实验流程。如需对分选后的细胞进行后续培养，必须标记其表面指标。

荧光素选择：推荐选择荧光亮度高且发射波峰差距大的荧光素，以减少信号间的相互干扰。在指标与荧光素搭配时，必须遵循流式配色的关键原则。

此外，合理设置对照组有助于提高分析结果的准确性。常用对照包括单染对照、同型对照、荧光减一（FMO）对照等。对照设置的方法可参考以往的流式课堂。

3. 抗体染色

抗体染色是实现抗体识别目标蛋白，并将流式抗体上的荧光素特异性标记到目标细胞的过程。在使用抗体时，应尽量避免重复冻融。

以下是抗体染色过程中可能出现的一些情况：
① 抗体用量问题：用量过多可能导致背景信号增强，反之则染色结果不明显。可通过抗体滴定实验调整抗体用量至适宜范围。
② 固定/破膜时的染色：对于需要同时检测细胞表面和胞内抗原的实验，建议在固定/破膜前进行细胞表面抗原的染色。
③ 死细胞染色：死细胞常会产生自发荧光或非特异性吸附荧光抗体，导致假阳性。建议使用适当的生死染料对死细胞进行染色。
④ 荧光猝灭：荧光素在强光照射下易发生猝灭，因此抗体的储存与孵育需在避光条件下进行。

4. 仪器检测

在上机前，需对流式细胞仪进行清洗，避免仪器中残留荧光染料，并使用200目左右的尼龙筛网过滤样本，以去除样本中的团块。

细胞染色完成后，应尽快进行检测，以免长时间放置或不当保存导致荧光素亮度降低。

上机时应根据阴性对照的信号调整各检测通道的电压，以确保样本信号完整显示，并保持实验中的电压不变。同时，需设定合适的信号收集阈值，以提高信号采集效率。

为确保获得可进行统计分析的有效数据，通常有效细胞信号需在15000-20000以上，而多层次圈门中比例极小的细胞群，建议目标细胞群数量不少于500。

结束采集后，应及时清洗仪器，避免荧光染料残留或细菌生长。

以上是俄罗斯专享会294总结的流式实验注意事项，祝大家能够获得优异的实验结果！如有更多流式实验经验和心得，欢迎与我们沟通交流。有关流式实验的精彩内容，请继续关注俄罗斯专享会294。